ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА НА Т-ЛИМФОЦИТЫ ТИМУСА КРЫС IN VITRO ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИНГИБИТОРОВ РАЗНЫХ КЛАССОВ

Введение. Эритропоэтин (ЭПО)– физиологический стимулятор эритропоэза. Одним из основных эффектов ЭПО является снижение скорости апоптоза эритроидных клеток-предшественниц в костном мозге. Протекторные свойства ЭПО продемонстрированы при различных заболеваниях в клинических и экспериментальных условиях. Ранее было установлено, что ЭПО оказывает активирующее воздействие на Т-лимфоциты (ТЛЦ), сопровождающееся увеличением количества флуоресцирующих митохондрий в клетке (n_m/c ), имеющих протонный потенциал (Δφm), и (или) ростом внешнего мембранного потенциала (Δφp). Цель исследования – оценка реакции ТЛЦ на ЭПО после воздействия специфических ингибиторов реакций фосфорилирования в дыхательной цепи. Материал и методы. Исследовалось влияние ЭПО («Eprex», Cilag) на ТЛЦ крыс in vitro после их деэнергизации несколькими ингибиторами: динитрофенолом (ДНФ) – ингибитором дыхательной цепи и разобщителем окислительного фосфорилирования; пентахлорфенолом (ПХФ) – разобщителем окислительного фосфорилирования; дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД) – ингибитором мембрансвязанной части АТФ-азы митохондриальной мембраны с помощью потенциалчувствительного витального флуоресцентного зонда-катиона 4-(n-диметиламиностирил)-1- метилпиридиния (ДСМ). ТЛЦ выделяли из тимусов по стандартной методике. Окрашенные ДСМ клетки исследовали на люминесцентном микроскопе («Люмам – И2», ЛОМО, Россия) с использованием термостатированного столика. В каждом препарате измеряли флуоресценцию 50–70 клеток и рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции ТЛЦ (F ~ ). В каждой флуоресцирующей клетке подсчитывали n_m/c. Статистическую обработку данных экспериментов проводили по коэффициенту корреляции рангов Спирмена. Результаты и обсуждение. В экспериментах с ТЛЦ из разных тимусов зарегистрировано снижение n_m/c и F ~ после инкубации со всеми использованными ингибиторами, причем степень и скорость снижения этих параметров зависела от типа ингибитора и длительности инкубации. Максимальное снижение энергетики ТЛЦ достигалось при инкубации с ДНФ, после которого ЭПО не восстанавливает F ~ и n_m/c. После инкубации с ПХФ ЭПО восстанавливает ~20–23 % n_m/c и F ~ . Реакция ТЛЦ на ДЦКД подтверждает важную роль АТФ-азы в поддержании мембранного митохондриального потенциала. После деэнергизации ТЛЦ под действием ДЦКД ЭПО восстанавливает ~ 42 % n_m/c и ~ 38 % F ~ . Выводы. ЭПО способен частично восстанавливать поляризацию мембран митохондрий в ТЛЦ, нарушенную в результате воздействия ДЦКД.

1. Jelkmann W., Gross A. J. Erythropoietin. – Berlin; N.-Y.: Springer-Verlag; Yeidelberg, 1989. – 180 p.

2. Осиков М. В., Григорьев Т. А., Федосов А. А. и др. Влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов // Соврем. пробл. науки и образования. – 2012. – № 6. URL: https://elibrary.ru/download/elibrary_23220530_33460976. pdf (дата обращения 18.12.2017).

3. Бакшеев В. И., Коломоец Н. М. Эритропоэтин в клинической практике // Клин. мед. – 2007. – № 85 (9). – С. 30–37.

4. Biggar P., Kim G. H. Treatment of renal anemia: Erythropoiesis stimulating agents and beyond // Kidney Res Clin Pract. – 2017. – № 36 (3). – Р. 209–223.

5. New Treatment Approaches for the Anemia of CKD / M. Bonomini, L. Del Vecchio, V. Sirolli , F. Locatelli // Am. J. Kidney Dis. – 2016. – № 67 (1). – Р. 133–142.

6. Livnah O., Johnson D. L., Stura E. A. et al. Anantagonist peptide-EPO receptor complex suggests that receptor dimerization is not sufficient for activation // Nature Structural & Molecular Biology. – 1998. – № 5 (11). – Р. 993–1004.

7. Сараева Н. О. Использование рекомбинантного эритропоэтина в гематологической практике // Сибир. мед. журн. – 2006. – № 64 (6). – С. 5–10.

8. Исследование роли межклеточных взаимодействий в регуляции эритропоэза в эритробластических островках костного мозга / Ю. М. Захаров, И. Ю. Мельников, Н. В. Тишевская, С. А. Шевяков // Вестн. Уральской мед. академ. науки. – 2015. – № 55 (4). – С. 59–62.

9. Механизм влияния эритропоэтина на количественный состав лимфоцитов крови при экспериментальной термической травме / Т. В. Осиков, Е. В. Симонян, О. Т. Саедгалина, А. А. Федосов // Соврем. проблемы науки и образования. – 2016. – № 2. URL: https://elibrary.ru/ download/elibrary_25869790_84106576.pdf (дата обращения 18.12.2017).

10. Rocha J., Eduardo-Figueira M., Barateiro A. et al. Ery thropoietin reduces acute lung injury and multiple organ failure/dysfunction associated to a scald-burn inflammatory injury in the rat // Inflammation. – 2015. – № 38 (1). – Р. 312–326.

11. Lifshitz L., Avneon M., Prutchi-Sagiv S. et al. Immunomodulatory functions of Erythropoietin // Focus uniluebeck Supplement. – № 28. – 2009.

12. Todosenko N. M., Shmarov V. A., Malashchenko V. V. et al. Erythropoietin exerts direct immunomodulatory effects on the cytokine production by activated human T-lymphocytes // Int. Immunopharmacol. – 2016. – № 36. – Р. 277–281.

13. Wang S., Zhang C., Li J. et al. Erythropoietin protects against rhabdomyolysis-induced acute kidney injury by modulating macrophage polarization // Cell Death Dis. – 2017. – № 8 (4). – Р. e2725.

14. Stimulating effect of erythropoietin on thymocyte energetics established in vitro with a potential-sensitive fluorescent probe in the mitochondria / G. I. Morozova, T. V. Parkhomenko, O. A. Klitsenko, V. V. Tomson // Biochem. Suppl. Series A: Membr. Cell Biology. – 2007. – № 1 (4). – Р. 325–330.

15. Quantitative evaluation of erythropoietin (EPO) in fluence on rat T-lymphocytes / T. V. Parkhomenko, G. I. Morozova, O. A. Klytsenko, V. V. Tomson // Annals of Hematology. – 2000. – № 79 (5). – Р. B8.

16. Evaluation of restoring erythropoietin (EPO) effect on rat T-lymphocytes after their treatment with some inhibitors in vitro // T. V. Parkhomenko, G. I. Morozova, O. A. Klytsenko, V. V. Tom- son // Annals of Hematology. – 2003. – № 82 (6). – Р. S114.

17. Артюхов В. Г., Путинцева О. В., Брагина В. А. и др. Флюоресцентные методы в исследовании УФ-индуцированных изменений структурно-функционального состояния лимфоцитов крови человека // Бюлл. эксперимент. биол. и мед. – 2012. – № 153 (6). – С. 891–895.

18. The erythropoietin (EPO) response of cells isolated from rat thymuses in vitro / T. V. Parkhomenko, G. I. Mo-ro zova, O. A. Klytsenko, V. V. Tomson // Focus uni-luebeck Supplement. –2009. – № 32.

19. Futai M., Noumi T., Maeda M. ATP-synthase (H+-ATP-ASE) – results by combined biochemical and molecular biological approaches // Annual Review of Biochemistry. – 1989. – № 58. – Р. 111–136.

20. Clejan L., Bosch C. G., Beattie D. S. Inhibition by dicyclohexylcarbodiimide of proton ejection but not electron-transfer in rat-liver mitochondria // Journal of Biological Chemistry. – 1984. – № 259 (21). – Р. 13017–13020.

21. Linnane A., Lukins H., Nagley P. et al. Assembly of the yeast mitochondrial H+ATP-ase correlative studies involving gene sequencing and immunochemical probes of assembly // Achievements and perspectives of mitochondrial research. – 1985. – № 1 (Bioenergetics). – Р. 211–222.