uzspbgmuУчёные записки Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. ПавловаThe Scientific Notes of the Pavlov University1607-41812541-8807Academician I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University10.24884/1607-4181-2018-25-1-56-61uzspbgmu-422Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫORIGINAL PAPERSВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА НА Т-ЛИМФОЦИТЫ ТИМУСА КРЫС IN VITRO ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИНГИБИТОРОВ РАЗНЫХ КЛАССОВEFFECT OF ERYTHROPOIETIN ON T-LYMPHOCYTES OF THE THYMUS OF RATS IN VITRO AFTER EXPOSURE TO INHIBITORS OF DIFFERENT CLASSESПархоменкоТ. В.ParkhomenkoT. V.parhomenkotv@1spb-gmu.ruКлыценкоО. А.KlytsenkoO. A.parhomenkotv@1spb-gmu.ruТомсонВ. ВэTomsonV. V.nic.spb@mail.ruГалибинО. В.GalibinO. V.ogalibin@mail.ruФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-ПетербургРоссияFederal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Pavlov First Saint Petersburg State Medical University» St. PetersburgRussian Federation2018300320182515661Copyright © Пархоменко Т.В., Клыценко О.А., Томсон В.В., Галибин О.В., 20182018Пархоменко Т.В., Клыценко О.А., Томсон В.В., Галибин О.В.Parkhomenko T.V., Klytsenko O.A., Tomson V.V., Galibin O.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.sci-notes.ru/jour/article/view/422

Введение. Эритропоэтин (ЭПО)– физиологический стимулятор эритропоэза. Одним из основных эффектов ЭПО является снижение скорости апоптоза эритроидных клеток-предшественниц в костном мозге. Протекторные свойства ЭПО продемонстрированы при различных заболеваниях в клинических и экспериментальных условиях. Ранее было установлено, что ЭПО оказывает активирующее воздействие на Т-лимфоциты (ТЛЦ), сопровождающееся увеличением количества флуоресцирующих митохондрий в клетке (nm/c ), имеющих протонный потенциал (Δφm), и (или) ростом внешнего мембранного потенциала (Δφp). Цель исследования – оценка реакции ТЛЦ на ЭПО после воздействия специфических ингибиторов реакций фосфорилирования в дыхательной цепи. Материал и методы. Исследовалось влияние ЭПО («Eprex», Cilag) на ТЛЦ крыс in vitro после их деэнергизации несколькими ингибиторами: динитрофенолом (ДНФ) – ингибитором дыхательной цепи и разобщителем окислительного фосфорилирования; пентахлорфенолом (ПХФ) – разобщителем окислительного фосфорилирования; дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД) – ингибитором мембрансвязанной части АТФ-азы митохондриальной мембраны с помощью потенциалчувствительного витального флуоресцентного зонда-катиона 4-(n-диметиламиностирил)-1- метилпиридиния (ДСМ). ТЛЦ выделяли из тимусов по стандартной методике. Окрашенные ДСМ клетки исследовали на люминесцентном микроскопе («Люмам – И2», ЛОМО, Россия) с использованием термостатированного столика. В каждом препарате измеряли флуоресценцию 50–70 клеток и рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции ТЛЦ (F ~ ). В каждой флуоресцирующей клетке подсчитывали nm/c. Статистическую обработку данных экспериментов проводили по коэффициенту корреляции рангов Спирмена. Результаты и обсуждение. В экспериментах с ТЛЦ из разных тимусов зарегистрировано снижение nm/c и F ~ после инкубации со всеми использованными ингибиторами, причем степень и скорость снижения этих параметров зависела от типа ингибитора и длительности инкубации. Максимальное снижение энергетики ТЛЦ достигалось при инкубации с ДНФ, после которого ЭПО не восстанавливает F ~ и nm/c. После инкубации с ПХФ ЭПО восстанавливает ~20–23 % nm/c и F ~ . Реакция ТЛЦ на ДЦКД подтверждает важную роль АТФ-азы в поддержании мембранного митохондриального потенциала. После деэнергизации ТЛЦ под действием ДЦКД ЭПО восстанавливает ~ 42 % nm/c и ~ 38 % F ~ . Выводы. ЭПО способен частично восстанавливать поляризацию мембран митохондрий в ТЛЦ, нарушенную в результате воздействия ДЦКД.

Introduction. Erythropoietin (EPO) – physiological stimulator of erythropoiesis. It activates the mitosis and maturation of red blood cells from progenitor cells erythroid series. One of the main effects of EPO is the slowdown in the rate of apoptosis of erythroid progenitor cells in the bone marrow. Protective properties of EPO demonstrated in various diseases in clinical and experimental conditions. Previously, it was found that activating EPO-effect on T-lymphocytes (TLC) may result not only to the increase of the number of fluorescent mitochondria in cell (nm/c) with proton potential (Δφm), but also external growth of growth of external membrane potential electric potential of plasma (Δφp). The objective of this work was to investigate the TLC response upon EPO after exposure to specific inhibitors of phosphorylation reactions in the respiratory chain. Material and methods. We studied EPO («Eprex», Cilag) effect on rat TLC in vitro after their deenergization by several inhibitors: dinitrophenol (DNP) - uncoupler of oxidative phosphorylation and ingibitor of respiratory chain), pentachlorphenol (PCP)- uncoupler of oxidative phosphorylation, N,N -dicyclohexylcarbodiimide (DCCD)- of Ca2+- inhibitor of the membranebound part of the mitochondrial membrane ATP-ase with the help of a potential-sensitive vital fluorescent probe-cation 4-(p-dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium (DSM). Rat TLC were isolated from thymuses according to the standard method. The microfluorimetric studies of DSM-stained TLC were performed by means of fluorescent microscope («Lumam I- 2», «LOMO», Russia) with thermostatic table. Fluorescence of 50–70 single cells was measured in each specimen, mean fluorescence intensity of TLC (F ~ ) was calculated. In addition, n m/c was calculated in each fluorescent cell. Statistical processing of the experimental data was performed by the Spearman’s rank correlation coefficient. Results and discussion. In experiments with TLC from different thymuses, we registered a decrease in F ~ and n m/c after incubation with all used inhibitors. It was found that the difference in decrease velocity of nm/c and of F ~ depended on the type of inhibitor and on the duration of incubation. Maximum reduction of energy of the TLC achieved by incubation with a DNF, after which the EPO does not recover F ~ and m/c. After incubation with PCP, EPO restores ~ 20–23 % m/c and F ~ . The reaction of TLC on the DCCD confirms the important role of the ATP-ase in the maintenance of mitochondrial membrane potential. After deenergization of TLC under the action of DCCD, EPO has the maximum effect: restored ~ 42 % n m/c and ~ 38 % F ~ . Conclusions. EPO is able to partially recover the polarization of the mitochondria membranes in TLC violated as a result of exposure to DCCD.

эритропоэтинТ-лимфоцитыэнергетическая активностьингибиторыпотенциалчувствительный витальный флуоресцентный зонд-катион 4-(n-диметиламиностирил)-1-метилпиридинияerythropoietinT-lymphocytesenergy activityinhibitorspotential-sensitive vital fluorescent probe-cation 4-(p-dimethylaminostyryl)-1-methylpyridiniumReferencesJelkmann W., Gross A. J. Erythropoietin. – Berlin; N.-Y.: Springer-Verlag; Yeidelberg, 1989. – 180 p.Jelkmann W., Gross A.J.(Eds.). Erythropoietin,Springer-Verlag Berlin Yeidelberg New York, 1989,180 p.Осиков М. В., Григорьев Т. А., Федосов А. А. и др. Влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов // Соврем. пробл. науки и образования. – 2012. – № 6. URL: https://elibrary.ru/download/elibrary_23220530_33460976. pdf (дата обращения 18.12.2017).Osikov M.V., Grigoryev T.A., Fedosov A.A., Kozochkin D.A., Ilinykh M.A. Effect of erythropoietin on the functional activity of platelets. Modern problems of science and education. 2012. № 6. URL: https://elibrary.ru/download/elibrary_23220530_33460976.pdf.Бакшеев В. И., Коломоец Н. М. Эритропоэтин в клинической практике // Клин. мед. – 2007. – № 85 (9). – С. 30–37.Baksheyev V. I., Kolomoyets N. M. Erythropoietin in clinical practice. Clinical medicine. 2007; 85 (9):30-37.Biggar P., Kim G. H. Treatment of renal anemia: Erythropoiesis stimulating agents and beyond // Kidney Res Clin Pract. – 2017. – № 36 (3). – Р. 209–223.Biggar P, Kim GH. Treatment of renal anemia: Erythropoiesis stimulating agents and beyond. Kidney Res Clin Pract. 2017; 36(3):209-223.New Treatment Approaches for the Anemia of CKD / M. Bonomini, L. Del Vecchio, V. Sirolli , F. Locatelli // Am. J. Kidney Dis. – 2016. – № 67 (1). – Р. 133–142.Bonomini M1, Del Vecchio L2, Sirolli V3, Locatelli F2. New Treatment Approaches for the Anemia of CKD. Am J Kidney Dis. 2016; 67(1):133-42.Livnah O., Johnson D. L., Stura E. A. et al. Anantagonist peptide-EPO receptor complex suggests that receptor dimerization is not sufficient for activation // Nature Structural & Molecular Biology. – 1998. – № 5 (11). – Р. 993–1004.Livnah O, Johnson DL, Stura EA, Farrell FX, Barbone FP, You Y, Liu KD, Goldsmith MA, He W, Krause CD, Pestka S, Jolliffe LK, Wilson IA. Anantagonist peptide-EPO receptor complex suggests that receptor dimerization is not sufficient for activation. Nature Structural & Molecular Biology.1998; 5 (11): 993–1004.Сараева Н. О. Использование рекомбинантного эритропоэтина в гематологической практике // Сибир. мед. журн. – 2006. – № 64 (6). – С. 5–10.Saraeva N. About. The use of recombinant erythropoietin in haematological practice. Siberian medical journal. 2006; 64(6): 5-10. ( in Russ.).Исследование роли межклеточных взаимодействий в регуляции эритропоэза в эритробластических островках костного мозга / Ю. М. Захаров, И. Ю. Мельников, Н. В. Тишевская, С. А. Шевяков // Вестн. Уральской мед. академ. науки. – 2015. – № 55 (4). – С. 59–62.Zakharov Yu. M., Melnikov I. Y., Tasevska N. In. The sheviakov A. A. study of the role of intercellular interactions in the regulation of erythropoiesis in erythroblastosis islets of the bone marrow. Bulletin of the Ural medical academic science. 2015; 55(4): 59-62. ( in Russ.).Механизм влияния эритропоэтина на количественный состав лимфоцитов крови при экспериментальной термической травме / Т. В. Осиков, Е. В. Симонян, О. Т. Саедгалина, А. А. Федосов // Соврем. проблемы науки и образования. – 2016. – № 2. URL: https://elibrary.ru/ download/elibrary_25869790_84106576.pdf (дата обращения 18.12.2017).Osikov M.V., Simonyan E.V., Saedgalina O.T., Fe-do sov A.A. Mechanisms of erythropoietin influence on the quantitative composition of blood lymphocytes in experimental thermal injury. Modern problems of science and education. 2016. № 2. URL: https://elibrary.ru/download/ elibrary_25869790_84106576.pdf. ( in Russ.).Rocha J., Eduardo-Figueira M., Barateiro A. et al. Ery thropoietin reduces acute lung injury and multiple organ failure/dysfunction associated to a scald-burn inflammatory injury in the rat // Inflammation. – 2015. – № 38 (1). – Р. 312–326.Rocha J, Eduardo-Figueira M, Barateiro A, Fernandes A, Brites D, Pinto R, Freitas M, Fernandes E Mota-Filipe H, Sepodes B. Erythropoietin reduces acute lung injury and multiple organ failure/dysfunction associated to a scald-burn inflammatory injury in the rat. Inflammation. 2015; 38(1):312-26.Lifshitz L., Avneon M., Prutchi-Sagiv S. et al. Immunomodulatory functions of Erythropoietin // Focus uniluebeck Supplement. – № 28. – 2009.Lifshitz L., Avneon M., Prutchi-Sagiv S., Katz O., Gassmann M., Mittelman M., Neuman D. Immunomodulatory functions of Erythropoietin. Focus uni-luebeck Supplement. 2009; 28.Todosenko N. M., Shmarov V. A., Malashchenko V. V. et al. Erythropoietin exerts direct immunomodulatory effects on the cytokine production by activated human T-lymphocytes // Int. Immunopharmacol. – 2016. – № 36. – Р. 277–281.Todosenko NM1, Shmarov VA1, Malashchenko VV1, Meniailo ME1, Melashchenko OB1, Gazatova ND, Goncharov AG1, Seledtsov VI2. Erythropoietin exerts direct immunomodulatory effects on the cytokine production by activated human T-lymphocytes. Int Immunopharmacol. 2016; 36:277-281.Wang S., Zhang C., Li J. et al. Erythropoietin protects against rhabdomyolysis-induced acute kidney injury by modulating macrophage polarization // Cell Death Dis. – 2017. – № 8 (4). – Р. e2725.Wang S1,2, Zhang C1,2, Li J1,2, Niyazi S1,2, Zheng L1,2, Xu M1,2, Rong R1,2,3, Yang C1,2, Zhu T1. Erythropoietin protects against rhabdomyolysis-induced acute kidney injury by modulating macrophage polarization. Cell Death Dis. 2017; 8(4):e2725.Stimulating effect of erythropoietin on thymocyte energetics established in vitro with a potential-sensitive fluorescent probe in the mitochondria / G. I. Morozova, T. V. Parkhomenko, O. A. Klitsenko, V. V. Tomson // Biochem. Suppl. Series A: Membr. Cell Biology. – 2007. – № 1 (4). – Р. 325–330.Morozova G.I., Parkhomenko T.V., Klitsenko O.A., Tomson V.V. Stimulating effect of erythropoietin on thy mocyte energetics established in vitro with a potential-sensitive fluorescent probe in the mitochondria. Biochem. Suppl. Series A: Membr Cell Biology. 2007; 1 (4):325-330.Quantitative evaluation of erythropoietin (EPO) in fluence on rat T-lymphocytes / T. V. Parkhomenko, G. I. Morozova, O. A. Klytsenko, V. V. Tomson // Annals of Hematology. – 2000. – № 79 (5). – Р. B8.Parkhomenko T.V., Morozova G.I., Klytsenko O.A., Tomson V.V. Quantitative evaluation of erythropoietin (EPO) influence on rat T-lymphocytes. Annals of Hematology. 2000; 79 (5): B8.Evaluation of restoring erythropoietin (EPO) effect on rat T-lymphocytes after their treatment with some inhibitors in vitro // T. V. Parkhomenko, G. I. Morozova, O. A. Klytsenko, V. V. Tom- son // Annals of Hematology. – 2003. – № 82 (6). – Р. S114.Parkhomenko T.V., Morozova G.I., Klytsenko O.A., Tomson V.V. Evaluation of restoring erythropoietin (EPO) effect on rat T-lymphocytes after their treatment with some inhibitors in vitro. Annals of Hematology. 2003;82 (6):S114.Артюхов В. Г., Путинцева О. В., Брагина В. А. и др. Флюоресцентные методы в исследовании УФ-индуцированных изменений структурно-функционального состояния лимфоцитов крови человека // Бюлл. эксперимент. биол. и мед. – 2012. – № 153 (6). – С. 891–895.Artuhov VG, Putinzetva OV, Bragina VA, Pashkov MV, Vasilenko DV. Fluorescent methods in the research induced by UV radiation changes of structural and functional state of human blood lymphocytes. Bull Exp Biol Med 2012; 153(6):891-895.The erythropoietin (EPO) response of cells isolated from rat thymuses in vitro / T. V. Parkhomenko, G. I. Mo-ro zova, O. A. Klytsenko, V. V. Tomson // Focus uni-luebeck Supplement. –2009. – № 32.Parkhomenko T.V., Morozova G.I., Klitsenko O.A.,Tom-son V.V. The erythropoietin (EPO) response of cells isolated from rat thymuses in vitro. Focus uni-luebeck Supplement. 2009:32.Futai M., Noumi T., Maeda M. ATP-synthase (H+-ATP-ASE) – results by combined biochemical and molecular biological approaches // Annual Review of Biochemistry. – 1989. – № 58. – Р. 111–136.Futai M., Noumi T., Maeda M. ATP - synthase (H+- ATP - ASE) – results by combined biochemical and molecular biological approaches. Annual Review of Biochemistry. 1989; 58:111-136.Clejan L., Bosch C. G., Beattie D. S. Inhibition by dicyclohexylcarbodiimide of proton ejection but not electron-transfer in rat-liver mitochondria // Journal of Biological Chemistry. – 1984. – № 259 (21). – Р. 13017–13020.Clejan L., Bosch C.G., Beattie D.S. Inhibition by dicyclohexylcarbodiimide of proton ejection but not electron-transfer in rat-liver mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 1984; 259 (21):13017-13020.Linnane A., Lukins H., Nagley P. et al. Assembly of the yeast mitochondrial H+ATP-ase correlative studies involving gene sequencing and immunochemical probes of assembly // Achievements and perspectives of mitochondrial research. – 1985. – № 1 (Bioenergetics). – Р. 211–222.Linnane A., Lukins H., Nagley P., Marzuki S., Ha-di kusumo R., Jean-Francois M., John U., Ooi B., Wat-kins L., Willson T., Wright J., Meltzer S. Assembly of the yeast mitochondrial H+ATP-ASE correlative studies involving gene sequencing and immunochemical probes of assembly. Achievements and perspectives of mitochondrial research.1985;1(Bioenergetics): 211-222.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.